UNIVERSITATEA DE MEDICINA SI FARMACIE "GR. T. POPA"-IASI
FACULTATEA DE BIOINGINERIE MEDICALA
Master an I
Introducere
Screening-ul microbian de baza a fost folosit pentru identificarea agentilor antimicrobieni, de exemplu agentii citotoxici anticancerigeni. Biotehnologia a facut posibila clonarea unor proteine tinta si selectarea in vitro a unor sisteme celulare, dar unele sisteme nu si-au manifestat in aceste conditii intreaga lor activitate.
Aceste sisteme celulare au avut nevoie de alte modificari chimice, pentru reglarea permeabilitatii peretelui celular si pentru a-si manifesta activitatea selectiva asupra proteinelor tinta.
Sistemele celulare mimeaza mediul natural al proteinelor tinta, proteinele comportandu-se chiar mai bine in acest mediu artificial.
Multe afectiuni implica interactiuni ale complexelor proteice, unele interactiuni fiind incomplet cunoscute. Aceste interactiuni proteice pot fi mai bine observate in sistemele celulare in vitro, decat in celulele libere analizate.
Avantajele sistemelor de screening celular
In ultimii ani s-a observat ca screening-ul celular furnizeaza avantaje semnificative, care permit o dezvoltare rapida a sintezei medicamentelor.
Desi multe enzime pot sa fie clonate si utilizate pentru a produce mari cantitati de proteine, nu este intotdeauna usor de furnizat o cantitate suficienta de enzime pentru a fi folosite in screening-ul de inalta selectivitate.
Un dezavantaj al acestei metode, folosind celule de mamifere, este obtinerea conditiilor favorabile de crestere a celulelor, astfel incat sa se produca cantitati necesare de celule pentru screening.
Pretul crescut si dificultatea obtinerii unui numar mare de celule pot fi reduse folosind sisteme miniaturizate. Sistemele miniaturizate pot contine mai multe tipuri de celule; in plus daca nu exista interactii intre tintele urmarite, pot fi analizate mai multe tinte diferite, utilizand acelasi sistem, pastrand costul la acelasi nivel.
Se pot testa medicamente tinta prin screening celular, fara a cunoaste toate interactiile proteice necesare activitatii celulei, de exemplu: interactia proteinelor pe caile biochimice sau metabolice, activatorii sau inhibitorii transcriptiei.
Screening-ul microbian de baza
Biotehnologia a facut posibila proiectarea genelor proteinelor mamiferelor in sistemele microbiene. Proteinele obtinute in acest fel sunt folosite fie pentru analize biochimice si structurale, fie sunt utilizate in clinica. Proteinele se gasesc in incluziuni corpusculare, pentru a fi activate sunt izolate, solubilizate si "repliate". O serie de proteine care necesita modificari posttranslationale (de ex.: glicozilare) nu se obtin in sisteme celulare, dar aceasta nu constituie o piedica a testelor screening. Glicozilarea este necesara in celulele mamiferelor pentru stabilitatea proteinelor si pentru transport. Sistemele microbiene ofera avantaje semnificative dezvoltarii si raspandirii screening-ului celular, deoarece aceste sisteme sunt ieftine, usor de crescut si manipulat si deoarece proteinele mamiferelor pot fi usor clonate si exprimate in ele.
Permeabilitatea celulelor
Un avantaj al sistemelor celulare libere este acela ca orice compus activ poate fi identificat, iar un al doilea avantaj este acela ca se pot diferentia celulele permeabile, de cele impermeabile. Desi clonarea noilor tinte de interes este usor de realizat in sistemele microbiene, celulele microbiene au dezvoltat o membrana si un perete celular impermeabile, care sa le permita supravietuirea in mediu; in acest caz tinta poate deveni greu accesibila produsilor testati prin screening inalt selectiv.
In general celulele mamiferelor sunt mai permeabile decat cele microbiene, si deci screening-ul celular microbian este probabil lipsit de acei compusi care nu au strabatut peretele celular si bariera mebranara; in plus multe microorganisme au un sistem de eflux foarte eficient, care pompeaza compusii in afara celulei; permeabilitatea celulara redusa si sistemul de eflux sunt similare in cazul testelor cu rezistenta multidrog (RMD), existenta in celulele tumorale. Sistemele de eflux sau transportorii sunt numiti transportori ABC, acestia s-au pastrat de la bacterii la om.
Tehnologia moleculara genetica a facut posibila depasirea barierelor si a permis dezvoltarea screening-ului pe sisteme microbiene, devenind o alternativa productiva si ieftina la alte sisteme screening.
Saccharomyces cereviseae (drojdia) si Escherichia Coli au devenit cele mai populare microorganisme utilizate pentru acest sistem de screening, datorita posibilitatii de a le manipula genetic cu usurinta.
Deoarece Saccharomyces cereviseae este o eucariota este considerata ca fiind cel mai recomandat sistem pentru dezvoltarea screening-ului celulelor de mamifere tinta; dar Escherichia Coli are celulele mai permeabile decat ale drojdiei, este mai usor de manipulat si necesita un timp de crestere mai scurt, 6-8 ore, fata de 48 h necesare cresterii Saccharomyces cereviseae.
A. Dezvoltarea permeabilitatii celulelor de Saccharomyces cereviseae
Tipul primitiv de Saccharomyces cereviseae este complet impermeabil datorita membranei si peretelui celular. Peretele celular este considerat ca fiind ca o plasa si ca ar permite mai ales moleculelor mici sa-l strabata. In orice caz membrana celulara este considerata ca fiind complet impermeabila.
Recent s-a obseravt ca celulele de drojdie sunt de fapt permeabile si ca absenta efectului medicamentului testat se datoreaza activitatii mai multor sisteme de eflux, apartinand familiei transportorilor ATP dependenti, numite PDR, care pompau compusii (drogul) in exterior. S-a facut transcriptia factorilor responsabili de expresia genica a acestor transportori, mutatia unora a determinat rezistenta la medicament, iar a altora a dus la cresterea sensibilitatii la medicament; mai mult s-au obtinut drojdii foarte sensibile. Drojdiile mutante obtinute sunt organismele ideale pentru a fi folosite ca si gazda pentru dezvoltarea screening-ului. Imbunatatirea permebilitatii drojdiei a fost legata si de deletia genei YOR1, care codifica alti transportori ATP dependeti. Modelul mutant de drojdie s-a dovedit a fi mai permeabil pentru molecule mici, decat era modelul "primitiv". Un dezavantaj ale acestor mutatii il constituie afectarea cresterii si dificultatea trasformarii.
B. Dezvoltarea permeabilitatii celulelor de E. coli
E. coli este o
bacterie gram negativa care are o membrana externa si o
membrana interna si un spatiu periplasmatic intre cele
doua membrane. Membrana externa are un strat lipopolizaharidic
si un numar de proteine, numite
Relevanta biologica a sistemelor de screening microbian
Desi sistemele microbine sunt mai putin complicate decat sistemele celulare ale mamiferelor, omologi ai multor proteine ale mamiferelor s-au gasit in aceste sisteme. 21% din genele clonate, care sufera mutatii in timpul afectiunilor umane isi au un corespondent in secventele de Saccharomyces cerevisiae. In plus, multe alte proteine ale mamiferelor, care nu au un coresponent structural, dar au unul functional, pot fi folosite pentru a realiza complementaritatea functionala in celulele microbiene.
Spre desoebire de organismele superioare, la drojdii si la E. coli, la jumatate din gene functia este cunsocuta pe baza similitudinii dintre secventele de aminoacizi cu alte proteine, cu functie cunoscuta. Mecanismele biologice observate prin studii pe celule microbiene sunt aplicabile si in cazul eucariotelor superioare, deci cunostintele despre functia proteinelor microbiene pot ajuta la elucidarea functiei multor proteine ale mamiferelor. Asemanarea dintre organismele vii a fost notata de Jacques Monod: "ce este adevarat pentru E. coli este adevarat si pentru elefant".
Complementaritatea functionala poate fi folosita pentru a obtine un screening in care activitatea genelor heterologe este esentiala pentru supravietuire.
Atata timp cat activitatea biologica este complementara, aceasta metoda de screening constituie un succes, chiar daca proteinele omologe sunt limitate. Dificultatea acestei metode consta in manipularea expresiei genelor heterologe pentru obtinerea unui fenotip surogat si pentru a crea "design-ul microbian".
A. Complementaritatea tintelor omoloage
- Screening-ul de baza realizat pe S. cerevisiae pentru studiul imunosupresoarelor
Imunosupresoarele, ca cicosporina si FK 506, care inhiba activitatea celulelor T, au facut posibila realizarea transplantului de tesututuri si organe. Activitatea antifungica si mecanismul imunosupresor ale ciclosporinelor si ale FK 506 au fost mult timp necunoscute, putand fi studiate in prezent folosind S.cerevisiae. Ciclosporina si FK 506 leaga proteinle ce contin peptidul prolil-izomeraza activa si formeaza un complex ce inhiba fosfataza Ca, calmodulina si calcitonina. S-a observat ca exista importante asemanari intre activitatea imunosupresoarelor asupra celulelor T si asupra celulelor de drojdie. In prezenta acestor medicamente imunosupresoare, dupa expunerea la feromonii drojdiei (α factor) - celulele de drojdie nu se mai divid si nu mai cresc.
Mecanismul de actiune a unui alt imunosupresor - Rapamycina, a fost elucidat prin studii facute pe drojdie. Rapamycina are ca tinta o enzima implicata in fosforilarea protein fosfatazei 2A, enzima numita TOR. Acest fenomen poate fi folosit ca baza de screning pentru imunosupresoare.
Multe medicamente utilizate in clinica au ca tinta proteina G transmembranara cuplata cu receptorii (GPCR); receptorii pentru serotonina, dopamina, receptorii adrenergici.
Canalele de K+ sunt tinte importante pentru medicamentele ce se administreaza in afectiunile cardiovasculare, imunologice si neurologice. Screening-ul canalelor de K necesita echipamente scumpe si tehnici dificile. Dezvoltarea unei tehnici simple pentru screening-ul de inalta selectivitate este bine venita. Un screenig functional simplu s-a dezvoltat folosind complementaritatea transportorilor de potasiu (TrK) in drojdie.
Canalul M2 al virusului gripal este un canal protonic ce se regaseste in celulele infectate si poate fi exprimata si la nivelul celulelor de S. cereviseae; aceste canale au rolul de a creste aciditatea mediului in care virusul isi devarsa capsida. Canalele protonice M2 cresc permeabilitatea membranara a celulelor de drojdie pentru ionii rezultati in urma pierderii viabilitatii celulelor vecine. In scopul de a dezvolta o metoda de screening pentru a gasi inhibitori ai proteinei M2 s-a facut o clonare si o exprimare a genei responsabile de sinteza galactozei in celulele de drojdie.
Pentru gasirea liganzilor corespunzatori receptorilor hormonilor steroidieni s-a proiectat screening-ul pe celulele de S. cerevisiae, celule ce contin receptori pentru hormonii steroidieni.
Captothecin este un agent anticancerigen, a carui tinta este topoizomeraza; activitatea acestei enzime inregistreaza o crestere in timpul ciclului de diviziune celulara. S-au cautat chemotipuri inhibitoare ale topoizomerazei; aceste chemotipuri s-au cautat folosind screening-ul pe sisteme celulare libere, fiind greu de utilizat screening-ul de inalta selectivitate.
Cautarea inhibitorilor specifici ai topoizomerazei s-a dovedit a fi dificila si prin screning pe sisteme celulare libere.
Topoizomeraza 1 umana si topoizomeraze 1 E. coli difera prin reactiile pe care le catalizeaza si prin faptul ca nu au omologi.
Dezvoltarea screening-ului este utilizata pentru descoperirea inhibitorilor proteazei.
Proteaza a fost folosta ca tinta pentru diferite medicamente utilizate in unele afectiuni ca hipertensiunea arteriala, HIV. Testele enzimatice au fost folosite in screning-ul inhibitorilor proteazei. Sistemele microbiene au constituit o alternativa pentru screening-ul proteazei si au prezentat avantajul ca nu necesita producerea unei mari cantitati de enzima. Mediul inconjurator natural al proteazelor este reprezentat de citoplasma; un alt avantaj al sistemelor microbiene il constituie faptul ca acestea furnizeaza un mediu mult mai asemanator cu cel natural al proteazelor, decat pot oferi sistemele celulare libere.
Dificultatea obtinerii inhibitorilor proteazelor (proteaza citomega-lovirusului, proteaza virusului hepatitei C) este reprezentata de faptul ca aceste enzime au ca tinta un substrat natural complex. In cadrul sistemelor microbiene pot fi proiectate aceste substraturi (tinte pentru proteaze).
Expresia functionala a tirozinkinazei si fosfatazei
Tirozinkinaza reprezinta o tinta importanta pentru descoperirea medicamentelor utilizate in oncologie, imunologie si alte arii terapeutice. Deoarece aceasta enzima este usor de produs, la analiza acestei tinte s-au utilizat sisteme de celule libere. Pentru identificarea inhibitorilor tirozinkinazei se poate folosi o metoda alternativa, screening-ul sistemelor microbiene (Schizosaccharomyces pombe).
Adaptand aceasta metoda de screening se pot determina si inhibitorii tirozin-fosfatazei. Modificarea consta in coexprimarea tirozinfosfatazei pe un plasmid secundar. In cazul in care ambele enzime sunt coexprimate in celulele sistemului microbian, celulele supravietuiesc la actiunea agentului terapeutic, in ciuda exprimarii genetice a tirozinkinazei. Inhibitorii tirozinfosfatazei pot fi identificati in acest sistem, urmarind agentii ce omoara selectiv celulele pe a caror suprafata sunt coexprimate si kinaza si fosfataza.
Concluzii
Sistemele microbiene furnizeaza o alternativa la screening-ul inalt selectiv (HTS). Aceste sisteme sunt ieftine si permit o dezvoltare rapida a screening-ului pe ele. Un alt avantaj al acestor sisteme este faptul ca pot fi adaptate pentru testarea diferitelor clase de substante care au ca tinta GPCRs (proteine G cuplata cu receptorii), receptori transmembranari, tirozinkinaza, tirozin fosfataza, canalele ionice.
Screening-ul functional a devenit necesar pentru dezvoltarea screening-ului proteinelor, a caror functie biologica este incomplet cunoscuta. Aceasta metoda a devenit preferata in cercetarea medicamentelor, datorita usurintei cu care se realizeaza tintele.
Descoperirea unor produsi folositi in medicina si agricultura prin screening molecular genetic
Eforturile pentru a descoperi substante care sa trateze afectiunile umane sau care sa combata daunatorii din agricultura, au continuat timp de mai multe secole. Primele descoperiri din ambele domenii se datoreaza mai mult sansei, iar informatiile privind aceste descoperiri au fost raspandite anecdotic.
De exemplu, folosirea in medicina a unor extracte de plante ce contin glicozide cardiotonice a fost initial descoperita in urma unor observatii intamplatoare, extractele continand acesti compusi erau cunoscute ca fiind folosite de vechii egipteni si romani.
Prima descriere moderna despre folosirea terapeutica a celui mai utilizat (in clinica) glicozid cardiotonic - digitala (Digitalis purpura), a fost realizata in 1785 de William Withering. Desi Withering aprecia utilitatea clinica a digitalei, baza farmacologica a actiunii substantei nu a fost inteleasa la timp.
Un
exemplu asemanator, din domeniul agricol este descoperirea
amestecului de
Au fost descrise numeroase descoperiri intamplatoare, cu siguranta acestea difera de cele contemporane, bazate pe un program de cercetare chimica pentru a descoperi substantele dorite. Imbunatatirea sintezelor chimice a moleculelor organice a facut posibila sinteza unor molecule, ce pot fi cercetate ca agenti farmacologici.
Descoperirea proprietatilor anestezice ale eterului se datoreaza activitatii biologice neprevazute a moleculelor organice relativ simple.
O alta descoperire, aceea a aspirinei, se bazeaza pe sinteza unor substante asemanatoare substantelor derivate din plante, cunoscute ca avand actiuni terapeutice.
Sinteze reale, la scara mare si programe de screening au devenit posibile in secolul al XX-lea, ca urmare a evolutiei sintezei compusilor organici si a descoperirii utilitatii terapeutice a metabolitilor microbieni.
Un exemplu clasic de program de screening chimic este descoperirea DDT-ului. DDT-ul a fost sintetizat in 1874 de Zeidder, ca parte a unui program de cercetare si sinteza a compusilor organici. Acest compus a fost mai tarziu redescoperit de Muller si colaboratorii, in 1939 intr-un program de screening si sinteza chimica, ce a condus la identificarea unor insecticide imbunatatite.
Un alt exemplu este screening-ul extractelor microbiene pentru antibiotice, screening initiat in cateva laboratoare ce urmareau descoperirea penicilinei. Penicilina a fost descoperita in 1929 de catre Fleming si a fost mai tarziu evaluata clinic si caracterizata de Florey. Deoarece penicilina este un derivat al unor fungi saprofiti, Walksman si colaboratorii au concluzionat ca bacteriile degradative din sol pot produce de asemeni substante utile terapeutic. Acesti cercetatori au initiat un program de screening a produsilor de fermentatie din Actinomycetele din sol pentru identificarea antibioticelor active pe bacilul tuberculozei, tuberculoza fiind o boala incurabila inaintea descoperirii Streptomicinei de catre Waksman.
Atat descoperirea Penicilinei, cat si a Streptomicinei au in comun faptul ca ambele descoperiri se adresau nevoilor societatii si ambele au fost distinse cu Premiul Nobel, in plus in ambele cercetari s-au folosit, pentru identificarea substantelor active, organisme surogat sau culturi tinta, care erau supuse apoi unor serii de teste (screening secundar), terminand cu evaluarea clinica ("in viata reala").
Se stie ca substantele selectate prin screening-ul primar nu vor fi utilizate la clinica si nici comercializate. In urma screening-ului secundar se inlatura moleculele nedorite si se obtin rezultate de succes.
Screening-ul contemporan infrunta numeroase provocari. Este deosebit de dificil sa descoperi noi cai de obtinere a moleculelor din surse testate anterior. Noile produse trebuie sa demonstreze o superioritate neta pentru tratarea curenta a diferitelor afectiuni, pentru a fi folosite si a fi acceptate pe piata. Dezvoltarea rezistentei la produsele existente necesita descoperirea unor produse active pe noi receptori tinta. Din fericire noile metode existente sunt capabile sa faca fata provocarilor existente. Tehnicile moleculare au facut posibila identificarea suprafetelor receptoare cu actiune rapida si au indicat potentialele tinta pentru medicamentle testate. Tehnicile biochimice si biologia moleculara au permis proiectarea testelor de screening bazate pe mecanismele de actiune mai exact decat a permis biologia generala, si au relevat aspecte importante ale sistemelor biologice.
Aceste metode au fost folosite din 1970 si au devenit mai valoroase o data cu cresterea logaritmica a disponibilitatii secventei de ADNc informationale.
Utilizarea drojdiei - Saccharomyces cerevisiae pentru aceste teste este favorita din trei motive:
Prezinta mari asemanari functionale cu Eucariotele superioare;
Prezinta un genom complet secvential;
Poate fi manipulata cu mare eficienta permitand dezvoltarea rapida a screening-ului si analiza tintelor terapeutice.
Screening-ul molecular pe drojdie furnizeaza legaturi directe si importante intre genele si medicamentele testate, permitand rapida cercetare a secventei de ADN informational pentru descoperirea medicamentelor.
Expresia functionala a canalelor (heterologe) de poatsiu in drojdie
Folosirea celulelor de Saccharomyces cerevisiae ca gazda pentru expresia canalelor de potasiu a fost posibila datorita avansarii intelegerii reglarii homeostaziei ionilor de potasiu. Afinitatea inalta a captarii potasiului in drojdie este mediata de trasportorii ce capteaza potasiul, codificati de TRK1; TRK2 codifica trasnportorii cationici cu afinitate scazuta pentru potasiu. Captarea potasiului se datoreaza in parte activitatii electrice a pompei de protoni (Pma 1p) a membranei plasmatice, care stabilieste o inalta hiperpolarizare a potentialului membranar permitand acumularea unei mari cantitati de potasiu intracelular, prin cresterea valorii medii a concentratiei potasiului.
Celulele de drojdie lispsite de o afinitate crescuta pentru potasiu, datoreaza captarea acestor ioni dublei mutatii a genelor trk1s trk2s, incapabile a se dezvolta intr-un mediu lipsit de potasiu sau in care se gaseste insuficient potasiu. Acest fenotip functional face posibila clonarea canalelor de potasiu, care suplinesc capacitatea scazuta de captare a potasiu din celulele de drojdie.
O varietate a canalelor de potasiu din surse heterologe a fost clonata prin complementaritatea defectelor de crestere a celulelor de drojdie, determinata de dubla mutatie a genelor trk1s trk2s.
Vectorii
expresiei canalelor de potasiu in drojdie au fost folositi pentru
obtinerea fragmentelor de ADNc informational ce permit producerea
de proteine heterologe. Transferul genelor trk1s
si trk2s intr-un mediu cu un
continut scazut de potasiu, permite supravietuirea doar a acelor
gene care contin fragmente de ADNc informational, a
caror exprsie furnizeaza o afinitate crescuta pentru recaptarea
potasiului. Primele canale de potasiu clonate pe aceasta cale au fost
inrudite cu cele ale plantelor KAT1 si
AKT1. Aceste canale ce par compuse
din 6 domenii transmembranare si un domeniu formator de
Recent au fost exprimate functional in drojdie canalele de potasiu ale unor specii de animale.
Canalele
de potasiu apartinand speciei Drosophila
melanogaster ORK1, singurele
canale de potasiu compuse din 4 domenii transmembranare si un domeniu
formator de
Reglarea interna a canalelor de potasiu IRK1 din porcii de Guineea este de asemenea capabila sa suporte cresterea deficientei de captare a potasiului ca si in cazul celulelor de drojdie. Singurul domeniu transmembranar al unui canal cationic neselectiv ce s-a aratat functional in drojdie este cel al virusului gripal M2. Expresia canalului M2 in celulele de drojdie interfera cu mentinerea gradientului electrochimic al protonului, ducand la inhibarea cresterii. Fenotipul este reversibil prin adaugarea amantadinei in canalele inhibitoare. Activitatea celulelor de drojdie in care se exprima genele canalelor RK1 si ale virusului a fost evaluata prin microfiziometrie.
In multe cazuri canalele de potasiu heterologe au fost exprimate in celulele de drojdie mentinand gradul de sensibilitate si gradul de raspuns farmacologic, ceea ce sugereaza ca aceasta configuratie poate fi folosita pentru HTS (hygh throghput screening), utilizat pentru gasirea moleculelor mici modulatoare ale activitatii canalelor de poatsiu. Numeroase studii au demonstrat capacitatea compusilor blocanti ai canalelor de potasiu de a avea acelasi efect si asupra canalelor heteroloage exprimate in celulele de drojdie.
Receptorii citoplasmatici - sunt liganzi ce leaga factorii de transcriptie. Toti, cu exceptia receptorilor aril-bicarbonat (Ah R) sunt membrii ai familiei de steroizi clasici care sunt parte a superfamiliei receptorilor nucleari. Deoarce receptorii Ah R sunt caracterizati in studiile biochimice ca receptori steroidieni, alti posibili receptori steroidieni pot fi de fapt membrii ai familiei structurale HLH - PAS. Caracteristicile biochimice ale receptorilor citoplasmatici arata ca acestia sunt compusi mici lipofili, ale caror dimensiuni sunt de 350 D, prezinta o specificitate si o eficienta desavarsita si mediaza procesele fiziologice vitale ale vertebratelor si artropodelor. Steroizii si mimeticele sintetice au utilizare medicala pentru diferite afectiuni: osteoporoza, cancerul, afectiuni inflamatorii; de asemenea au utilizari in agricultura.
Majoritatea acestor compusi a fost descoperita prin metode de screening clasic.
Odata cu dezvoltarea cunostintelor despre structura 3D a acestor receptori si a proteinelor ce mediaza transcriptia receptorilor, este posibila selectarea medicamentelor functie de tinta pe care actioneaza si de liganzi.
Drosophila melanogaster a ramas dupa un deceniu de cercetari cel mai potrivit candidat pentru studierea comportamentului nuclear receptor-like al receptorilor hormonilor juvenili; acesti receptori au fost recent identificati ca fiind membri ai familiei bHLH-PAS. D. Melanogaster are 18 receptori nucleari, 6 sunt membri ai familiei bHLH-PAS.
Caracteristicile structurale ale receptorilor citoplasmatici determina cerintele specifice si strategiile pentru proiectarea metodei de screening.
Superfamilia receptorilor nucleari este impartita in patru grupe pe baza legarii ADN-ului si a proprietatii de dimerizare. Familiile I si II sunt legate de liganzi, iar familiile III si IV sunt receptori nelegati la liganzi (receptori orfani).
Familia I - include receptori steroidieni: receptori ai hormonilor glucocorticoizi, mineralocorticoizi, estrogeni, progestativi. In absenta liganzilor acesti receptori sunt localizati in citoplasma, in asocierea cu proteine coagulate. Prezenta liganzilor produce eliberarea proteinelor care sunt translocate in nucleu.
Familia a II-a include receptori care heterodimerizeaza cu 9-cis retinoid X receptor (RxR) si care leaga elementele de raspuns hormonal (HRE) in absenta liganzilor. Bazandu-se pe consensul HRE, a fost recent subdivizata in doua familii. Aceasta subdivizare serveste doar pentru ghidare, deoarece membrii acestei familii functioneaza ca hibrizi ai familiei I si II de receptori.
In familia III - elementele de raspuns hormonal sunt legate ca monomeri, iar in familia IV ca dimeri.
Proteina G cuplata cu receptorii (GPCRs) - studii numeroase au indicat expresia GPCRs, expresie studiata in celule de S. Cerevisiae si alte celule fungice si obtinuta in prezenta unor antagonisti functionali, legati de situsurile membranare.
A fost nevoie de introducerea unui numar de modificari in expresia GPCRs din drojdie, pentru cresterea utilitatii si flexibilitatii HTS si pentru a permite selectionarea genetica in prezenta agonistilor.
O a II-a modificare importanta a fost introdusa pentru a permite celulelor de drojdie sa creasca doar ca raspuns la un agonist.
Pentru noi descoperiri farmaceutice sunt necesare tehnici de screening caracterizate de o inalta selectivitate, sensibilitate si bine directionate (HTS). Aceasta s-a obtinut utilizand gene tinta, care au fost clonate si exprimate in sisteme celulare miniaturizate si rezistente. In aceste conditii HTS este ideal pentru studiul GPCRs.
Analiza prin HTS a GPCRs exprimata in celule de drojdie poate fi facuta pe placi acoperite cu agar sau in tavi de microtitrare.
Pe placile acoperite cu agar si culturile celulare utilizate ca gazda pentru expresia GPCRs se injecteaza din loc in loc compusul analizat, acesta difuzeaza radiar si va determina un raspuns doar la un anumit gradient de concentratie. Avantajul acestei metode este ca analiza poate fi facuta automatizat, se pot folosi compusi martor, de o concentratie bine determinata.
Un alt avantaj il constituie usurinta si acuratetea separarii unui compus studiat din diferite surse. Rezultatele testelor pot duce la identificarea antagonistilor la agonistii unui situs tina.
Un exemplu de reusita al HTS (pentru analiza GPCRs) il constituie testele facute pentru identificarea receptorilor adenozinei A2a (compus purinic, utilizat in medicina, agricultura).
Tinta terapeutica a agentilor terapeutici este imaginata cel mai ades ca fiind un receptor sau o enzima, unde medicamentul are ca actiune formarea unui agonist surogat, antagonist sau activarea unui situs inhibat. Tinta poate fi o proteina care functioneaza intr-un lant de reactii, intr-o "cascada" catalizata enzimatic. Agentul terapeutic poate fi vazut atunci ca o mica molecula ce altereaza interactia proteina-proteina. De exemplu: benzimidazolil - cunoscut compus antifungic si antitumoral, isi exercita actiunea prin intreruperea asamblarii unei proteine- tuberculina.
In unele situatii agentul terapeutic poate determina asocierea moleculelor de proteine.
Ca urmare a studierii afectiunilor infectioase au aparut cateva modele de screening genetic molecular.
Multi dintre agentii antiinfectiosi folositi curent in clinica sunt prousi de fermentatie, in contrast cu alte medicamente produse doar prin sinteza chimica.
Un indicator al importantei acestei probleme il reprezinta datele de la Institutul de chimie microbiana Kitasato, care prezinta peste 16.000 de substante distincte, active chimic, care au fost identificate din produsi naturali de fermentatie. Aceasta provocare a condus la dezvoltarea unor metode de analiza pentru identificarea selectivitatii si nivelului de toxicitate ale antibioticelor ce actioneaza pe tinte selective. Aceste teste au fost folosite si pentru evaluarea clinica a agentilor antimicrobieni.
Multe analize s-au dezvoltat prin exploatarea proprietatii genelor de a induce rezistenta la antibiotice, incluzand screening-ul compusilor lactamici like, tetraciclin-like, eritromicin-like.
Este foarte important ca in timpul analizei sa existe in laborator conditii de adaptare si automatizare a tehnicilor folosite. Operatiunile automatizate furnizeaza rezultate mai bune decat cele realizate manual. Automatizarea laboratorului permite analize de precizie, permite adaptabilitatea si flexibilitatea metodelor si asigura scaderea gradului de probabilitate al rezultatelor obtinute, duce la obtinerea unor rezultate sigure, reproductibile, usor de inregistrat, stocat, analizat, interpretat si utilizat. HTS a fost folosit pentru descoperirea moleculelor agoniste si antagoniste.
Mai mult de jumatate dinte medicamentele descoperite au ca tinta receptori membranari, receptori solubili si receptori-canale ionice. Receptorii au fost grupati in subfamilii pe baza similitudinii secventiale si structurale. Cateva subtipuri si izoforme au fost identificate pe baza tehnicilor biologiei moleculare, care au definit structura si functia familiei de receptori. Subfamilia de receptori dintr-o superfamilie poate avea liganzi diferiti si poate transmite semnale diferite. Subtipuri de receptori specifici medicamentelor au fost identificati prin HTS, folosind subtipuri de receptori umani exprimati in celule umane sau de mamifere. Substantele cu activitate terapeutica identificate prin HTS dau informatii despre specificitatea moleculara a subtipurilor de receptori, care pot fi efectiv folositi in eforturile de a descoperi subtipuri de receptori care au caracteristici farmacologice unice cu distributie tisulara specifica. Clonarea si exprimarea subtipurilor de receptori umani au furnizat tinte moleculare pentru descoperirea noilor subtipuri de medicamente selective pe tesuturile specifice, medicamente lipsite de efecte secundare asociate medicamentelor neselective.
Odata cu definitivarea secventei genomului uman au fost descoperite noi secvente de gene. Au fost identificati in genomul uman receptori ai caror functii nu erau cunoscute - receptorii "orfani" ai GPCRs, receptori nucleari, receptori transmembranari ai tirozinkinazei. Acesti receptori "orfani" vor fi folositi in cercetarile farmacologice doar dupa definirea functiei lor, dar elucidarea acestei probleme este o sarcina dificila, chiar folosind metode genetice. Cativa dintre acesti receptori orfani sunt tinte de imediat interes pentru descoperirea potentialelor medicamente, (ca si reprezentanti ai subfamiliei de receptori ce include tinte importante pentru agentii terapeutici).
Odata cu avansarea tehnologiilor si a strategiilor experimentale ale MTS prin miniaturizarea sistemelor celulare studiate, este posibila identificarea liganzilor care activeaza sau inhiba receptorii "orfani". Au fost dezvotate cateva metode biofizice sensibile capabile sa monitorizeze schimbarile moleculare din interiorul unei singure celule. Au fost utilizate noi metode de analiza biochimica si sisteme de analiza de inalta selectivitate a receptorilor ce moduleaza expresia genica, pentru identificarea liganzilor ce leaga receptorii "orfani".
O provocare curenta este determinarea functiei moleculare a receptorilor orfani astfel incat sa se poata determina receptorii urmariti in terapia anumitor afectiuni.
Caile de transmitere a semnalului sunt foarte complexe si aceste cai pentru fiecare subtip de receptor nu sunt bine definite. Progresul tehnologiilor de analiza si a instrumentarii va permite masurarea rapida a posibilelor semnale din celula si va face posibila elucidarea mecanismelor de transmitere a semnalelor cu mai multa precizie, permitand dezvoltarea medicamentelor specifice pentru receptorii tinta specifici.
Screening-ul activitatii noilor enzime
Cele mai multe studii si HTS au fost orientate asupra cautarii inhibitorilor enzimatici; de asemeni se practica HTS la o scara industriala pentru cercetarea activitatii enzimatice. Primul scop este descoperirea de noi biocatalizatori, dar nu peste mult timp screening-ul farmaceutic va putea fi folosit pentru cercetarea secventei ADN.
Screening-ul proteazelor, kinazelor sau fosfatazelor, enzime cu rol important in transmiterea semnalului, va avea abilitatea sa gaseasca noi tinte pentru clasele cunoscute de enzime.
Prin HTS s-au analizat gene ale organismelor termo- sau hipertermofile, prin clonarea expresiilor genetice si exprimarea acestora in variate sisteme gazda.
Tehnica trebuie sa fie suficient de rezistenta pentru a putea fi realizata in prezenta continutului celulei gazda si de obicei se folosesc substrate care genereaza produsi puternic absorbanti si fluorescenti.
Trecerea de la cercetarea bancilor de date ale analizelor la HTS automatizat, care sa pastreze caracteriticile esentiale ale probei este scopul tuturor metodelor de HTS de laborator. HTS enzimatic este o metodologie folosita pentru descoperirea medicamentelor. Dezvoltarea analizei prin HTS este o metoda ideala si usoara pentru cercetarea enzimelor.
Cand se intalneste modificarea comportamentului cinetic simplu al enzimelor trebuie sa se stabilizeze cu grija acest comportament pentru identificarea cauzelor si sa se gaseasca masuri de adaptare a HTS la acest comportament.
HTS este utilizat pentru descoperirea a noi enzime si a noi inhibitori.
