UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ TIMIŞOARA
Obiectivele pe anul 2004:
- Recoltarea şi conservarea probelor de lapte provenite de la vacile cu mamită acută.
- Aplicarea metodelor uzuale şi speciale pentru identificarea agenţilor etiologici în mamitele luate în studiu.
- Efectuarea lactocitogramelor.
Obiectivele pe anul 2005:
1. Studiul populaţiei celulare din lapte:
- stabilirea unor metode rapide şi eficiente pentru studiul citologic al laptelui;
- întocmirea tabelelor şi graficelor în care se precizează, procentual, variaţia tipurilor de celule din lapte.
2. Interpretarea datelor cumulate pe parcursul celor doi ani de cercetare:
- interpretarea şi prelucrarea statistică a lactocitogramelor;
- stabilirea existenţei corelaţiei între natura agentului patogen şi variaţia tipurilor de celule somatice din lapte;
- realizarea raportului final.
Introducere
Investigaţiile întreprinse au urmărit evidenţierea unei posibile corelaţii între natura agenţilor etiologici, pe de o parte, şi aspectul lactocitogramei (formula celulară a secreţiei mamare), pe de altă parte, pornind de la supoziţia că, totuşi diverşii agenţi etiologici nu vor induce în cadrul citogramei, creşteri numerice ale celulelor din lapte identice sau foarte apropiate ca proporţie.
Mamitele bacteriene sunt entităţi morbide cu semnificaţie economică deosebită la vaci, deoarece, pe de o parte produc pierderi mari în producţia de lapte (calitativ şi cantitativ) iar pe de altă parte impun cheltuieli suplimentare pentru medicamente şi tratamente.
Pierderile produse de mamitele clinice şi subclinice pot fi astfel împărţite:
- 14% sub formă de cazuri mortale, dar mai ales prin reformări de bovine înainte de vreme (datorită mamitelor incurabile);
- 8% sub formă de lapte care nu poate prelucrat pentru obţinerea produselor lactate (brânzeturi, iaurt, smântână etc.);
- 8% sub formă de cheltuieli pentru medicamente şi tratamente;
- 70% prin pierderi în producţie (după National Mastitis Council, 1974).
Un studiu efectuat în 1992 de către medicul veterinar Brouillet (membru al Comisiei de mamite şi calitatea laptelui din Comunitatea Europeană), arată că: "10 litri de lapte anormal care conţine rezidii sau substanţe inhibitoare, poate compromite în cursul prelucrării pentru consum până la 86000 litri lapte sănătos".
În scopul reducerii acestor pierderi este necesară instituirea unor metode cât mai rapide de diagnosticare etiologică a mamitelor.
De asemenea, importanţa şi semnificaţia celulelor din lapte pentru integritatea consumatorului este în prezent un deziderat unanim acceptat.
Literatura de specialitate internaţională a stabilit că exista o corelaţie între numărul celulelor din lapte şi starea de sănătate a glandei mamare la vacă, în sensul că, creşterea numărului de celule peste anumite limite denotă instalarea infecţiei mamare, dimensiunea conţinutului celular dând chiar indicaţii asupra stării (fazei) clinice a bolii.
Citirea şi interpretarea lactocitogramelor evidenţiază prezenţa procentuală a diferitelor tipuri de celule somatice din lapte şi anume: celulele de origine epitelială (provenite din epiteliul alveolar secretor al glandei mamare) şi celulele de origine sangvină (neutrofile, bazofile, eozinofile, macrofage şi limfocite - ajunse în lapte prin leucodiapedeza), cu precizarea că varietatea de celule întâlnite în lapte şi care trebuiesc identificate este mult mai mare.
Polimorfonuclearele neutrofile. Serieys şi Farault stabilesc statistic că frecvenţa polimorfonuclearelor neutrofile (PMN) variază procentual între 0-11% în laptele provenit de la vaci sănătoase, libere de infecţii ale glandei mamare, iar Ognean şi colab., în cadrul unui studiu citologic efectuat pe probe de lapte normal şi mamitic, provenite de la vaci de rasă Bălţată românească supuse unui muls mecanic, găsesc următoarele valori: 35,6% PMN în laptele sănătos, 28,9% în colostru, 11,5% în secreţia glandei mamare în faza de repaus şi 49,9% în laptele mamitic. Mai mulţi cercetători, printre care şi Baumgarther şi Hunder, încă din 1971, monitorizând evoluţia numărului de polimorfonucleare neutrofile din lapte, ajung la concluzia că acest tip de celule creşte semnificativ în situaţia în care numărul total de celule depăşeşte 100000 per ml lapte. Pentru a evidenţia această corelaţie, autorii mai sus menţionaţi au propus o formulă de calcul a numărului de celule somatice din lapte în funcţie de numărul de polimorfonucleare neutrofile, conform relaţiei:
Nr. total de polimorfonucleare = 0,79 X nr. total de celule - 74000
Afirmaţia că numărul de polimorfonuclearelor din lapte creşte semnificativ şi proporţional în cazul alterărilor tisulare sau infecţiilor glandei mamare este unanim acceptată.
Creşterea numărului de polimorfonucleare neutrofile în infecţiile glandei mamare se produce în corelaţie cu populaţia limfocitară, dar ponderea acestora este net şi constant mai mare faţă de cea a limfocitelor, depăşind-o de cel puţin 1,3 ori. În mamitele catarale, numărul polimorfonuclearelor poate ajunge la 70 - 75%, iar în formele supurative, la 80 - 85%, până la 90% - în formele grave.
Polimorfonuclearele neutrofile reprezintă o componentă esenţială a sistemului imun care funcţionează ca o primă linie de apărare împotriva infecţiilor bacteriene din glanda mamară. Deşi polimorfonuclearele neutrofile sunt benefice prin eliminarea agenţilor infecţioşi, prezenţa prelungită a acestor celule în ţesutul mamar se exprimă prin alterări la nivelul epiteliului secretor, cum sunt denudările, care conduc la scăderea definitivă a producţiei de lapte. Aceste injurii se produc în urma degranulării neutrofilelor, care eliberează radicali toxici ai oxigenului şi proteaze (substanţe chimice cu acţiune bactericidă dar şi citotoxică asupra ţesutului mamar). Prin urmare, eliminarea rapidă de către macrofage a polimorfonuclearelor neutrofile, consecutiv neutralizării bacteriilor, este esenţială pentru a minimaliza alterările tisulare de tip inflamator.
Polimorfonuclearele acidofile. Klimmer, precizează că într-un lapte normal, eozinofilele se găsesc în proporţie de 2%. Un studiu realizat de Mielke asupra polimorfonuclearelor eozinofile relevă apariţia acestora în anumite faze ale inflamaţiei glandei mamare, acelaşi autor realizând şi corelaţia privind prezenţa acestor celule în lapte şi modularea răspunsului imun.
Eozinofilele conţin în granulaţii substanţe care contracarează acţiunea bazofilelor şi mastocitelor şi se degranulează în urma fagocitozei particulelor inerte, bacteriilor opsonizate, complexelor antigen - anticorp şi în urma contactului cu un metazoar parazit.
Polimorfonuclearele bazofile. Până în prezent, în literatura de specialitate nu există date privind rolul activ al bazofilelor sau ponderea acestora în lapte.
Bazofilele, ca şi eozinofilele, prezintă capacităţi fagocitare şi bactericide reduse, dar intervin în reacţiile alergice şi inflamatorii, în metabolismul lipidelor şi în coagularea sângelui.
Limfocitele. Date cu privire la ponderea limfocitelor din lapte sunt mai puţin divergente, în comparaţie cu cele referitoare la exprimarea procentuală a polimorfonuclearelor neutrofile şi chiar a monocitelor macrofage. Astfel, Wahby şi Nasr estimează populaţia limfocitară în laptele sănătos la valori între 10 şi 27%. Lee şi colab. stabilesc valori între 15-16%. Petra Kurzhals citează şi cazuri în care limfocitele au reprezentat doar 1-2%, sau chiar au lipsit din populaţia celulară a laptelui, provenit de la vaci cu mamite subclinice. Ognean găseşte în cercetările sale că limfocitele variază astfel: 40,1% în laptele sănătos, 34% în colostru, 40,4% în laptele vacilor în faza de înţărcare şi numai 20,8% în laptele patologic. Studiind populaţia celulară evidenţiată pe frotiu la numeroase probe de lapte sănătos sau patologic, acelaşi autor explică faptul că valorile mici sau inexistenţa limfocitelor, la cazurile semnalate de către autorii de mai sus, apar datorită faptului că acestea se pot confunda uşor cu monocitele macrofage neactivate, prezente în lapte. De asemenea, în cazul instalării mamitelor, Yang şi colab.semnalează două fenomene: supresia limfocitelor B din sânge şi creşterea numerică a acestora în limfonodurile supramamare. Această creştere se explică prin faptul că după sensibilizarea acestora la locul de infecţie, limfocitele B migrează în ţesuturile limfoide secundare pentru a acţiona împotriva antigenelor prezente în centrii germinativi.
Limfocitele B realizează imunitatea umorală a organismului.
Limfocitele T sunt implicate, în principal, în răspunsul imun celular şi sunt stimulate numai de anumiţi antigeni şi de unele substanţe mitogene nespecifice, ca fitohemaglutinina şi concavalina A. De asemenea, limfocitele T reglează hematopoeza şi diferenţierea limfocitelor B în plasmocite.
Macrofagele. Cu privire la ponderea macrofagelor în populaţia celulară din lapte opiniile sunt foarte diferite.
Se estimează valori ce variază între 24 şi 88% din totalul celulelor identificate. Lee şi colab., Serieys şi Faraoult, consideră macrofagele ca dominante cu valori de 66-88%, în laptele vacilor care nu prezintă infecţii mamare.
Petra Kurzhals stabileşte că ponderea macrofagelor este de 60 % în laptele vacilor, cu un număr total de celule situat între 300000 şi 3000000 pe ml. Un studiu realizat pe 1000 de vaci cu mamită subclinică, permite autoarei să concluzioneze că, în cazul în care numărul total de celule creşte cu 1000 pe ml, ponderea macrofagelor scade cu 5%, în schimb creşte proporţia leucocitelor polimorfonucleare neutrofile cu 3%, a limfocitelor cu 0,18% şi a celulelor epiteliale cu 0,52%.
Mielke prezintă o altă opinie, şi anume că macrofagele se găsesc în proporţie de 17 - 20%, în laptele provenit din glanda mamară sănătoasă; în faza de platou a mamitei acute, proporţia creşte, iar în mamitele subclinice şi cronice, procentul macrofagelor este foarte ridicat, în special în infecţiile streptococice.
Conţinutul celular în laptele normal şi mamitic, după diverşi autori (original)
AUTORII STADIUL LACTAŢIEI NEUTROFILE MACROFAGE LIMFOCITE CELULE EPITELIALE ALTE CATEGORII DE CELULE / STRUCTURI CELULARE
NEIDENTIFICABILE
Norcross, N.L.
(1991) Colostru 61 35 4 0 -
Secreţia alveolară în repausul mamar 3 89 7 1 -
Lapte 3 80 15 2 -
Klimmer, M. (1956) Lapte 45 30 2 23 -
Paape, M.J. (1966) Lapte 26 35 24 15 -
Lee, C.S (1980) Lapte 3 79 16 2 -
Milke, H. (1980) Lapte 37 - 38 17 - 20 13 - 20 - 26 - 32
Ognean, L. (1995) Lapte 33,2 23,9 32,5 7,15 2,5
Kelly, A. L., (2000) Lapte 5 - 12 60 28 ?
Pamela Ruegg (2001) Lapte 0 - 11 66 - 88 10 - 27 0 - 7 -
Lapte mamitic > 90 2 - 10 2 - 10 0 - 7 -
Petra Kurzhals (1983) Lapte mamitic 33,88
(6-69) 1,6
(0-16) 62,14
(24-88) 2,38
(0-15) -
Diana Argherie (2005) Lapte 34,07 19,31 39,77 6,81 0,04
Exprimarea procentuală a fiecărui tip de celule somatice depinde de stadiul lactaţiei, sănătatea glandei mamare şi activitatea secretorie a epiteliului alveolar.
Este unanim acceptat faptul că toate tipurile de celule mai sus menţionate sunt prezente atât în laptele normal cât şi în cel patologic (mamitic), dar nu în aceeaşi proporţie procentuală.
Studiind tabelul de mai sus am ajuns la concluzia ca ponderea procentuală a tipurilor de celule somatice din lapte nu este pe deplin stabilit, existând încă diferenţe foarte mari.
Materiale şi metode
Pentru a studia aspectul citologic al celulelor din lapte a fost necesară îndeplinirea următoarelor obiective:
1. întocmirea unor fişe individuale de observaţie;
2. recoltarea probelor de lapte şi efectuarea examenului bacterioscopic şi bacteriologic;
3. efectuarea lactocitogramelor.
1. Întocmirea unor fişe individuale de observaţie.
Pentru a deţine o evidenţă corectă a probelor de lapte recoltate s-au realizat fişe individuale de observaţie pentru vacile examinate, în care au fost trecute următoarele date:
