Sinteza adn
Transmiterea corecta si integrala a informatiei genetice necesita existenta unei capacitati de autoreproducere a ADN
Autoreproducerea / sinteza este un proces precis integrat in ciclul celular ((G1 – presintetic, S – sintetic, G2 – postsintetic)
G1 – translatie, transcriptie;
S – sinteza = capacitatea de autoreproducere ADN prin replicarea semiconservativa (dintr-o molecula de ADN bicatenat => 2 molecule ADN bicatenare, identice cu molecula initiala )
= este un proces care are loc prin desfacerea progresiva a celor doua catene din molecula initiala=> tipare/matrite pe baza carora se vor reproduce prin complementaritate sinteza a doua noi catene => molecula bicatenara noua ce are o catena veche si una noua formata ( proces descris de Watson si Crick propun modelul replicarii, al fermoarului, datorita complementaritatii bazelor, fiecare baza expusa se va imperechea cu nucleotide libere din mediu).
=orice catena e tipar pentru noua molecula sintetizata => mecanism “furca de replicare evidentiat in vivo de Carius (1963) prin marcare cu tinidina tritiata urmata de auroradiografiere pe ADN bacterian
La procariote, replicarea incepe dintr-o origine fixa, apoi se bifurca bidirectional cu furci care se deplaseaza in directia opusa pana la intalnire.
La eucariote (pentru ca e mult ADN si sinteza e limitata in timp) replicarea incepe in mai multe puncte ( apar mai multe furci) care avanseaza bidirectional sau unidirectional.
MECANISMUL REPLICARII
Presupune pe langa catena tipar existenta unor alte elemente respectiv a 4 tipuri de dezoxinucleotizi trifosfati (din mediu : 3dATP;3’dGTP;5’dCTP; 5’dTTP;) in prezenta monocatenei ADN si a enzimelor ADN polimeraza si a ionilor de Mg2+ ele determina formarea unei catene ADN si cuplarea ei, cu eliminarea a n molecule de pirofosfat rezultat in urma aditiei mononucleotidelor
Primul ADN polimeraza a fost identificat de Kranberg la Escherichia Colli El a aratat ca este alcatuit dintr-un lant polipeptidic
Mecanismul de crestere al catenei ADN este determinat de ADN polimeraza; acest tip = ADN polimeraza I
In prezenta lantului polipeptidic (exista grup 3’ hidroxil libera) se permite aditia mononucleotidelor in directia 5’-3’, iar sinteza va decurge din nucleotid in nucleotid in directia 3’-5’
ADN polimeraza are 2 proprietati principale:
o activitatea catalitica ce permite alungirea catenei de ADN existente(aditia nucleotidelor la extremitatea 3’)
o activitatea exanucleozica
Pentru SINTEZA exista 3 etape>
1 Despiralizarea moleculei de ADN, in prezenta enzimelor de despiralizare; presupune actiunea unor endonucleaze (heliaze); simultan incepe si desfacerea puntilor de H =>desfacerea dublei catene(desfacerea in Y a moleculei initiale); are avantaj de aprox. 800 nucleotide fata de primele desfaceri ale puntilor de H
2 Asamblarea monomerilor liberi pe fiecare catena tipar; in prezenta ADN polimeraza => restabilirea legaturilor H( conform complementaritatii) (AT-GC)
3 Respilarizarea in prezenta heliazelor => dispozitia spatiala de dublu helix
Tot procesul de sinteza este organizat pe subunitati numite replicani( si reprezinta segmentul de unde incepe despiralizarea pana in punctul de inceput al urmatoarei furci de replicare)
La mamifere si la om un replican are o lungime de cca. 105 nucleotide.
O celula are 30-40 mii replicani . Rata de replicare 6-9000 nucleotide/minut
Punctul de initiere al fiecarui replican este fixat; avanseaza in directie opusa si spre (fiecare) urmatorul replican
!Problema ! - catenele sunt antiparalele
- sensul de aditie a ADN polimeraza este 3’-5’ si totusi furca este unidirectionala => ca exista o catena care se va replica in sens opus, neconform directiei ADN polimeraziei
=>Exista mecanisme care permit sinteza pe catena antiparalela 3’-5’
Studiind unele bacterii mutante, sarace in ADN polimeraza I s-a constatat ca exista si alte tipuri de ADN polimeraza - de tip II si III
Daca la ADN polimeraza II activitatea e redusa , ADN polimeraza III (13 segmente polipeptidice → nucleu si subunitati) se constata ca este principala enzima ce polimerizeaza sinteza ADN(pentru initierea sintezei este necesar un segment monocatenar de ADN)
ADN polimeraza III necesita existenta unui scurt segment de acid nucleic oligonucleotidic numit PRIMER . El este un scurt segment de ARN. In prezenta ADN polimeraza de tip III primerul de ARN este elongat in directia 3’-5’Sinteza primerului este realizata in prezenta unei enzime numite primaza care este controlata in sinteza de catre o gena DNA B, initial evidentiata la bacterii
In progresia catenei situsurile neacoperite din catena parentala (initiala) sunt trecute in secvente scurte de oligonucleotide ARN , ele au lungimi de cca 1000 nucleotide
Se schimba directia de sinteza, apoi urmeaza actiunea ADN polimeraza cu activitate exonucleazica tip 1 respectiv 3, care extrag nucleotid de nucleotid din ARN si il inlocuiesc cu monomeri liberi din mediu => secventa de ADN complementara, realizata pe baza secventei ARN (respecta directia ADN 5’-3’)
Fragmente OKAZAKI
Sunt fragmente alcatuite din primer-ADN +ARN care prin ligare(ligaza) sunt legate intre ele(realizeaza ADITIA) pe catena antiparalela 3’-5’ si se formeaza o catena noua pentru molecula de ADN corespunzatoar.
Rezulta ca: - Sinteza ADN se produce continuu pe catena 5’-3’ (catena conducatoare/leader)
- sinteza se produce fragmentat pe catena 3’-5’ (catena discontinua/intarziata)
Localizarea primerilor ARN se face prin proteine de recunoastere care recunosc situsurile unde poate actiona primerul (de aici se initiaza sinteza ARN → sinteza fragmentelor OKAZAKI) Mecanismul a fost descris de Okazaki in 1965
La E. Colli, primaza formeaza impreuna cu 2 secvente proteice un complex numit PRIMOZOM(primaza este determinata genetic de DNA –G, iar geneleDNA-B si DNA-C sunt gene care controleaza sinteza a cate unui compus proteic din primozomul alaturat primazei, sintetizata sub control DNA-G.)
Odata format, primozomul se transloca pe catena intarziata si initiaza sinteza secventei ARN. Dupa formarea fragmentelor Okazaki, fragmentele ADN se sudeaza in prezenta lipazelor(ligazelor)
Tot complexul , atat pe catena lider cat si pe catena intarziata formeaza un REPLIZOM = complex ce contine 2 catene ADN, subunitati proteice, enzime ce participa la sinteza si legarea fragmentelor Okazaki.. Se adauga si genele de control pentru primaza, proteine de recunoastere si enzime
Pentru eucariote starea normala a ADN – ului in cromozomi este o dispozitie specifica = NUCLEOZOM (superhelix) si la randul lor nucleozomii sunt organizati in structuri arhitectonice numite SOLENOIZI(supersuperhelixuri) Nucleozomii si solenoizii alcatuiesc cromozomii propriu-zis
La eucariote intervin si alte enzime care determina despiralizarea supersuperhelixurilor si superhelixurilor, enzime care se numesc TOPOIZOMERAZE (fac parte din categoria helicazelor) dar care vor despiraliza superhelixurile si vor permite expunerea moleculei de ADN si permit aparitia repliconilor, replisonilor, topoizomeraze – replicaze relaxeaza lantul ADN vor participa in cazul transcriptiei – relaxaze
La eucariote s-au descris mai multe tipuri de polimeraze:
α – principala enzima din replicarea ADN; blocarea ei inhiba sinteza ADN; mutantii nu replica ADN-ul la temperatura normala; localizata in nucleu, nu are activitate 3’-5’exanucleazica; functia sa principala este de sinteza si refacere pe catena discontinua
β – polimeraza care exista in nucleu si este implicata in repararea ADN-ului; fara activitate3’-5’ exanucleazica
γ – exista in mitocondrii, implicata in sinteza ADN-ului mitocondrial; cu activitate 3’-5’ exanucleazica
δ – exista in nucleu; a fost evidentiata initial in maduva osoasa; are proprietati asemanatoare cu α ; este implicata in sinteza continua
α + δ exista concomitent la nivelul complexelor replison. Se precupune ca au precursor comun; fata de α, δ are activitate 3’-5’ extranucleozotica. Pentru functionarea polimerazei δ este necesara prezenta unui cofactor (PCNA=ciclina) ; Cantitativ polimeraza δ creste in stadiul S.
ε – aceasta polimeraza se afla in nucleu si este implicata in repararea ADN; are activitate 3’-5’ extranucleazica
O data inceputa replicarea, rata de elongare a catenei este standardpentru fiecare celula.
Demonstrarea replicarii in vitro a fost facuta deMeselsohn si Sthal care au demonstrat pe E. Colli, utilizand ca marker izotopul reactiv azot 15 (N15) cu care au marcat catenele de ADN la E. Colli, modalitatea de distributie din generatie in generatie celulara a N15 in catenele ADN..
Din generatia fo toate celulele au N15 in structura ADN , dupa care , o trecere la f1 pe un mediu ce contine doar N14 urmat
de centrifugare in CaCl (?) la 105 G timp de 48ore pentrua se putea determina gradientul de densitate pentru moleculele ce contin N15si N14.
Determinarea s-a facut prin expunere la UV cu λ = 260 nm
Se constata in prima generatie existenta in proportii egale a N 14 si N 15. (Toate moleculele de ADN erau alcatuite din combinatii.)
Dupa a doua cultura rezulta o generatie cu N 15 si N14 sau numai N14 si N14
Dupa a III-a cultivare rezulta proportia 1xN14-N15 si 3x N14-N14 etc. => recombinarea in proportie egala semiconservativa a catenei ADN folosind monomeri din mediu cu N14
REPARAREA ADN
Pentru a functiona , este necesar ca ADN-ul sa-si deruleze corect replicarea si sa-si pastreze integritatea structurale si functiile. Exista posibilitatea aparitiei unor erori date de ADN polimeraza (leaga gresit un nucleotid in replicare) sau de factori exteriori (fizici, chimici) care constituie potential mutagen, Daca acesti factori cu potential mutagen actioneaza in G2 sau S determina erori. Daca celula nu ar avea modalitati de reparare, ar aparea disfunctii grave chiar moartea.
La E.Colli – 10-5-l0-6 gene/generatie in replicare dar eroarea ADN-ului polimeraza I este 1 baza la 104 cuplari internucleotidice.
Exista mecanism de corectare (autoreparare) a ADN polimerazei, eroarea este exclusa de enzima inainte de copiere prin activitate 5’-3’.
Daca la procariote s-a evidentiat capacitatea de corectie, la eucariote α,β,γ, nu au aceasta functie, doar eucariotele δ o au.
Exista mai multe modalitati de reparare:
- corectarea imediata a erorilor:→ prin activitatea exonucleazica se identifica si eleimina nucleotidele respective. Aceasta actiune se numeste capacitate de corectie –control polimerazic. . Si apoi, complementar , se leaga nucleotida corecta
- structura bicatenara a ADN implica o redundanta ceea ce va duce la o stabilitate a structurii ADN, iar daca pe catena apar leziuni, catena complementara va servi ca tipar pentru corectia acesteia,
S-au evidentiat mai multe modalitati de refacere:
1. prin FOTOREACTIVARE
2. prin DIALCHILARE
3. prin eliminarea bazelor modificate de catre enzime glicolitice
4. EXCIZIE si RESINTEZA
5. RECOMBINARE POSTREPLICATIVA
6. SISTEM INDUCTIBIL SOS
Mecanismele descrise difera ca strategie si eficienta si sunt de fapt, rezultat al evolutiei biologice.
1. REFACEREA PRIN FOTOACTIVARE
ADN-ul expus la UV (330450 nm) poate determina aparitia unor dimeri anormali (timidinici) ceea ce va determina eroare in structura catenei si in functie.
In prezenta unor enzime de fotoreactivare si expunerea la UV se permite excizia dimerului anormal si apoi refacerea din mononucleotide pe baza complementaritatii.
(folosit in tratamentele dermatologice).
Baza azotata ce urmeaza a fi cuplata e incorecta ; structura spatiala a ADN se mareste in volum , se blocheaza activitatea ADN-ului polimeraza => activitate exonucleazica 3’-5’ care va exciza baza necomplementara. Se corecteaza astfel eroarea, se reactiveaza capacitatea de legare a polimerazei.
2. DIALCHILARE
Exista substante care au capacitatea de alchilare, respectiv in cazul G≡C, alchilarea guaninelor determina aparitia unor erori in structura ADN ce se sintetizeaza – capacitate mutagena (cancerigena). Intervin in timpul replicarii prin cresterea in volum a moleculei ADN (permit intrarea in actiune a polimerazei), eliminarea fragmentelor si refacerea prin complementaritate => actiunea normala a ADN polimeraza
3. ELIMINAREA BAZELOR MODIFICARE DE CATRE ENZIME GLICOLITICE
Enzimele glicolitice au capacitatea de a hidroliza legatura N glicozidica dintre baza azotata si pentaza.a Actioneaza in prezenta purinelor care prezinta metilare la nivelul atomului de N7 si N3, in prezenta dimerilor de polimidina; recunosc si excizeaza mononucleotidele anormale si apoi se reface lantul normal
4. EXCIZIE SI RESINTEZA
Dupa recunoasterea leziunii lezate enzima specifica se leaga aici;Incizia 5’ a leziunii lezate;
ADN polimeraza se leaga la incizie si initiaza sinteza segmentului excizat utilizand ca primer gruparea 3’-OH a nucleotidului care margineste incizia si ca tipar/matrita catena complementara. Cand depaseste eroarea, efectueaza a doua incizie5’ si indeparteaza segmentul lezat.Apoi il inlocuieste cu segmentul nou creat.
5. RECOMBINARE POSTREPLICATIVA
Recombinarea postreplicativa implica repararea structurii de ADN folosind catena anormala. ADN polimeraza sare peste zona lezata si reincepe sinteza la o distanta de aprox. 100 nucleotide (?) fata de zona lezata. Apare o bresa in sinteza catenei nou formate, completata prin recombinarea catenei cu bresa cu catena normala. Astfel bresa nu mai este situata fata in fata cu regiunea lezata si se umple cu nucleotide prin complementaritate.
Acest mecanism nu repara leziuni primare , ci secundare, din molecula fiica. Astfel se limiteaza multiplicarea unor mutatii (anomalii) in decursul generatiilor celulare.
6. SISTEM INDUCTIBIL SOS
Refacerea prin sistemul inductibil S.O.S. se face cand leziunea este extrem de grava (nu poate fi reparata altfel si pericliteaza viata celului – ex. brese suprapuse). Acest sistem induce erori prin incorporarea de baze necorespunzatoare. Repararea permite continuarea vietii celulei dar aceasta este predispusa la erori si mutatii.
Leziunea originala ramane. Ea poate fi reparata sau nu. Daca nu e reparata se propaga si determina linii mutante.
